Informe Proteinas I
(Ignacio Monzalvo, Nicolás Reyes, Valentin Vazquez)
(Ignacio Monzalvo, Nicolás Reyes, Valentin Vazquez)
1)Resumen: En esta práctica lo que hicimos fue tomar algunas
muestras de proteinas extraidas de algunas sustancias y asi
reconocer que su naturaleza proteica.
Para esto utilizamos las siguientes muestras:
Para esto utilizamos las siguientes muestras:
Caseina,gelatina,ovoalbuina,aspartamo,glicina, porteinas del suero de la leche.
2)Materiales:
- Vaso de Bohemia
- Varilla de vidrio
- Mechero
- Soporte
- Tela metálica
- Gradilla
- Tubo de ensayo
- Termómetro
Sustancias:
- Leche descremada en polvo
- Gelatina
- Clara de huevo
- Edulcorante
- Ácido etanoico 2.0M
- NaOH al 10%
- CuSO4 al 1%
- Ácido nítrico concentrado
Fundamento de la Tecnica:
Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas .
Existen diferentes metodos para la cuantificacion de proteínas:
-La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV
- Para la formación de derivados químicos
-la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.
Ensayo de Biuret:
Está compuesto por hidroxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con
tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O. El reactivo es de color azul pero se torna violeta si hay presencia de proteinas.
La reacción del biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso hace que
un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos.
Una resultado negativo con una muestra de biuret no necesariamente quiere decir que no se encuentren proteinas en la muestra, puede ocurrir uno de los siguientes casos:
-Que no existan proteínas o péptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas)
-Que existan una o más sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un resultado falso negativo).
-Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método.
¿Como "funciona"?
Consiste en tratar una proteína o péptido con Cu++ en medio alcalino, produciéndose una coloración violácea por formación de un complejo de coordinación entre el Cu++ y los pares electrónicos libres de los nitrógenos de los grupos amino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción.
Ensayo de Xantroproteíco:
Esta reacción se usa para detectar la presencia de proteínas solubles en una solución. Se realiza mediante el uso de HNO3 concentrado que, en presencia de proteínas o aminoácidos con restos aromáticos torna la solución de un color amarillo oscuro.
Muestras sometidas a ensayo:
Caseína:
Es una proteína de carácter ácido debido a su elevada proporción de aminoácidos ácidos (PI=4,6).
La caseína humana es más rica en cistina y glúcidos que la vaca lo que la hace más apropiada para el bebé.
Reacciona con las bases formando caseinatos utilizados en la industria para la fabricación de colas y adhesivos. También se utiliza en la industria textil.
La caseína precipita por acción de los ácidos. Esto puede ocurrir a través de las formulación de ácido láctico por la acción bacteriana sobre la lactosa o mediante el agregado de un ácido hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico. La precipitación puede producirse por la acción enzimática de la quimiotripsina.
PROCEDIMIENTO
1) Colocamos aproximiadamente 25 ml de leche descremada en un vaso de Bohemia
2) Calentamos hasta aproximadamente 40ºC agitando con la varilla de vidrio.
3) Adicionamos ácido etanoico 2,0M (gota a gota) agitando en forma continua hasta coagulación total.
4) Separamos el cuágulo de caceína del suero mediante floración.
5) Secamos cuidadosamente la caceína con la ayuda del papel de filtro.
6) Separamos dos porciones del solido obtenido de aproximadamente 1 cm3 y las colocamos en dos tubos de ensayo.
Biuret: A uno de los tubos de ensayo le agregamos 10 gotas de CuSO4 y luego agregamos 3 gotas de NaOH al 1%.
Observamos que la solucion se torna violeta, por lo tanto sabemos que posee por lo menos 2 enlaces peptidicos.
Xantoproteica: Al otro tubo le agregamos 10 gotas de HNO3 concentrado.
Observamos que la solucion se torna amarilla y por lo tanto sabemos que hay tirosina o triptofano en la muestra.
GELATINA:
La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciónes de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría.
Al ser proteína en estado puro, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína (84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto). La gelatina se utiliza en la fabricación de alimentos para el enriquecimiento proteínico, para la reducción de hidratos de carbono y como sustancia portadora de vitaminas.
Procedimiento: Preparar la gelatina y colocarla en 2 tubos de ensayo.
Biuret: A uno de los tubos de ensayo le agregamos 10 gotas de CuSO4 y luego agregamos 3 gotas de NaOH al 1%.
Observamos que la muesta se torna violeta por lo tanto sabemos que la muestra posee al menos 2 enlaces peptidicos.
Xantoproteica: Al otro tubo le agregamos 10 gotas de HNO3 concentrado.
Vemos que la solucion es incolora por lo tanto la prueba da negativa y sabemos que la gelatina no tiene tirosina o triptofano.
OVOALBUMINA:
Las proteínas de la clara de huevo entran dentro de la definición de glicoproteínas, que son proteínas que llevan enlazados contenidos diversos de glúcidos a la cadena de aminoácidos. Entre éstas, la más abundante es la ovalbúmina, que es una fosfoglicoproteína.
La ovalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo y la que le da sus propiedades características (junto con la otra albúmina no fosforada).
La ovalbumina es, pues, una fosfoglicoproteína de 385 restos de aminoácido con un peso
molecular aproximado de unos 42.7 KDa. Es una proteína de referencia en bioquímica y es conocida a la industria alimentaria por sus propiedades como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones. Se desnaturaliza por calor a los 78ºC (temperatura de semidesnaturalización) perdiendo su estructura replegada de albúmina y produciendo un gel con gran retención de agua.
La ovalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo y la que le da sus propiedades características (junto con la otra albúmina no fosforada).
La ovalbumina es, pues, una fosfoglicoproteína de 385 restos de aminoácido con un peso
molecular aproximado de unos 42.7 KDa. Es una proteína de referencia en bioquímica y es conocida a la industria alimentaria por sus propiedades como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones. Se desnaturaliza por calor a los 78ºC (temperatura de semidesnaturalización) perdiendo su estructura replegada de albúmina y produciendo un gel con gran retención de agua.
Procedimiento:
Rompemos el huevo, separamos la clara de la yema, removemos la clara y la colocamos en agua. Luego colocamos parte de la solucion en dos tubos de ensayo y realizamos las reacciones ya mencionadas.
Biuret: A uno de los tubos de ensayo le agregamos 10 gotas de CuSO4 y luego agregamos 3 gotas de NaOH al 1%.
Observamos que la muesta se torna violeta por lo tanto sabemos que la muestra posee al menos 2 enlaces peptidicos.
Xantoproteica: Al otro tubo le agregamos 10 gotas de HNO3 concentrado.
Observamos que la solucion se torna amarilla y por lo tanto sabemos que hay tirosina o triptofano en la muestra.
ASPARTAMO:
El aspartamo es un edulcorante no calórico,es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 °C.La dulzura relativa del aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Es necesario destacar que todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces es obtenido en comparación con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa
El aspartamo es un edulcorante no calórico,es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 °C.La dulzura relativa del aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Es necesario destacar que todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces es obtenido en comparación con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa
PROCEDIMIENTO
1) Tomar una punta de espátula de edulcorante y colocarla en dos tubos de ensayo.
2) Agregar un poco de agua en cada uno de los tubos.
3) Realizar las reacciones mencionadas anteriormente.
Biuret: A uno de los tubos de ensayo le agregamos 10 gotas de CuSO4 y luego agregamos 3 gotas de NaOH al 1%.
La muestra no se pone violeta por lo tanto la muestra no presenta enlaces peptidicos.
Xantoproteica: Al otro tubo le agregamos 10 gotas de HNO3 concentrado.
Vemos que la solucion es incolora por lo tanto la prueba da negativa y sabemos que la gelatina no tiene tirosina o triptofano.
GLICINA:
La glicina es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula. Su fórmula química es NH2CH2COOH y su masa es 75,07. La glicina es un aminoácido no esencial.
PROCEDIMIENTO
1) Colocar una punta de espatula en un tubo de ensayo
2) Agregar un poco de agua
3) Realizar las reacciones mencionadas previamente
Biuret: A uno de los tubos de ensayo le agregamos 10 gotas de CuSO4 y luego agregamos 3 gotas de NaOH al 1%.
La muestra no se pone violeta por lo tanto la muestra no presenta enlaces peptidicos.
Xantoproteica: Al otro tubo le agregamos 10 gotas de HNO3 concentrado.
Vemos que la solucion es incolora por lo tanto la prueba da negativa y sabemos que la gelatina no tiene tirosina o triptofano.
Proteínas II
La purificación de proteínas consiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda de presión osmótica, es decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentes por una membrana semi permeable (una membrana que permite el paso selectivo de las moléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor peso molecular).
Asi podemos concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas. Este proceso se debe realizar a baja temperatura y en constante agitacion, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales
MATERIALES:
- Dializador
PARTE1:
1) Colocamos en dos tubos de ensayos muestra de la solución que se pondrá en el dializador.
2) Aplicamos la reacción de Biuret y AgNO3
3) Registramos las observaciones
- Dializador
- Clara de huevo
- AgNO3
- Vaso de Bohemia
- CuSO4 al 1 %
- NaOH al 10%
PROCEDIMIENTO:
PARTE1:
1) Colocamos en dos tubos de ensayos muestra de la solución que se pondrá en el dializador.
2) Aplicamos la reacción de Biuret y AgNO3
3) Registramos las observaciones
AgNO3 (Ag +) + (NO3-) (ac)
Catión Plata Anión Nitrato
NaCl (Na+) + ( Cl -) (ac)
Catión Sodio Anión Cloruro
Para luego:
(Ag+) (ac) + (Cl-) (ac) AgCl (s)
Cloruro de Plata
El cloruro de plata es un sólido blanco, y es su formación lo que determina que el ensayo sea positivo o negativo.
OBSERVACIONES:
Luego de realizar los pasos vemos que la reaccion dio positiva en ambos casos por lo tanto sabemos que la solución tiene sales y proteínas.
PARTE 2:
1) Colocamos dentro de un dializador una solución con proteínas y sales
2) Sumergimos en un vaso de Bohemia con agua destilada
3) Luego de varios minutos (20 aprox.), tomamos muestras de ambas partes del dializador.
4) Aplicamos los ensayos anteriores.
5) Registramos las observaciones.
2) Sumergimos en un vaso de Bohemia con agua destilada
3) Luego de varios minutos (20 aprox.), tomamos muestras de ambas partes del dializador.
4) Aplicamos los ensayos anteriores.
5) Registramos las observaciones.
OBSERVACIONES:
Baso de Bohemia que contenía agua destilada:
a) Biuret: NEGATIVO
b) AgNO3: POSITIVO
Podemos concluir que si bien el AgNO3 nos dio positivo, por lo tanto habia sales sales, que anteriormente no había dentro del baso de bohemia, el ensayo de Biuret nos dio negativo, lo que quiere decir que no habia proteínas en la muestra. Por lo tanto, las proteínas no atravesaron la membrana semi permeable del dializador.
Muestra dentro del dializador:
a) Biuret: POSITIVO
b) AgNO3: POSITIVO
Por los datos obtenidos, podemos afirmar que a pesar que el ensayo de AgNO3 dio positivo, la concentración de sales de la muestra bajo bastante. Como se menciono anteriormente, las proteínas de la muestra no pudieron atravesar la membrana semi permeable del dializador, razón por la cual el ensayo de Biuret dio positivo.
Baso de Bohemia que contenía agua destilada:
a) Biuret: NEGATIVO
b) AgNO3: POSITIVO
Podemos concluir que si bien el AgNO3 nos dio positivo, por lo tanto habia sales sales, que anteriormente no había dentro del baso de bohemia, el ensayo de Biuret nos dio negativo, lo que quiere decir que no habia proteínas en la muestra. Por lo tanto, las proteínas no atravesaron la membrana semi permeable del dializador.
Muestra dentro del dializador:
a) Biuret: POSITIVO
b) AgNO3: POSITIVO
Por los datos obtenidos, podemos afirmar que a pesar que el ensayo de AgNO3 dio positivo, la concentración de sales de la muestra bajo bastante. Como se menciono anteriormente, las proteínas de la muestra no pudieron atravesar la membrana semi permeable del dializador, razón por la cual el ensayo de Biuret dio positivo.
Esto nos permite concluir que la dialisis funciono.
